乙型肝炎诊断制剂

2020-08-29 食功效-药物药理学 https://www.shigongxiao.com

  乙型肝炎诊断制剂 : 乙型肝炎诊断制剂是用免疫学方法检测患者血中乙型肝炎各种不同抗原或相应抗体的试剂。
人体感染了乙型肝炎(乙肝)病毒后,在不同阶段血液及肝脏中可出现三种主要的抗原抗体系统: 即乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及抗乙型肝炎表面抗原的抗体(抗-HBs),核心抗原(HBcAg)及抗核心抗原的抗体(抗-HBc)和e抗原(HBeAg)及抗e抗原的抗体 (抗-HBe)。急性乙肝病人在感染后数日至数月内血液中常可检出HBsAg;感染两个月后逐渐出现抗-HBc,此抗体维持10~20周,以后逐渐下降,低滴度的抗-HBe表示曾经有过乙型肝炎感染,高滴度的抗-HBc表示乙肝病毒在体内持续增殖。抗HBs出现较晚,一直要到5~6月后抗体水平才逐渐上升; 至7~8月后逐渐下降,一年以后可维持在很低水平。HBsAg在病人血液中存在时间长短不一,大多数在疾病恢复前消失,一部分病例,可维持数月、数年或几十年成为长期携带者。关于HBeAg,最近有人认为: 它是乙型肝炎病毒核心的一个成分,存在于HBsAg阳性血血清内;所有HBeAg阳性者,HBsAg一定阳性;但低滴度的HBsAg阳性者,其HBeAg 不一定阳性,所以HBeAg 的阳性滴度与HBsAg的滴度高低呈正比; 血清中有HBeAg存在时,通过电镜检查,可见到高浓度的乙型肝炎病毒颗粒,也称为Dane颗粒,因此HBeAg的存在是机体感染乙型肝炎病毒的一个重要指标。母婴HBsAg传播中,HBeAg阳性的母亲,其婴儿HBsAg转阳率达80%~100%。
以上所述三种抗原抗体系统的检测在乙型肝炎的流行病学研究、传染原控制、临床诊断、疗效观察和预后推测等方面都有广泛用途; 如果在六个项目中任何一项阳性即表明机体正在受到或曾经有过乙型肝炎病毒感染。目前常用的乙肝诊断制剂可分表面抗原抗体系统、e抗原抗体系统和核心抗原抗体系统三类:
乙肝表面抗原抗体系统
(1) HBsAg诊断血清: 由乙肝感染后人的抗HBs或用纯化的HBsAg免疫动物产生的抗HBs血清,以生理盐水调整到一定滴度,经冷冻干燥或不经干燥制成。用琼脂免疫扩散法或对流免疫电泳法检测HBsAg,这些方法的敏感度较低,但特异性及实验稳定性较好,为最早使用的检测HBsAg的方法。
(2) HBsAg分型诊断血清:HBsAg有adr、adw、ayr、ayw四个主要亚型。按地区、人种有不同的分布,均已证明经传递而不改变。各亚型的HBV由不同基因遗传型所决定。世界各地流行分布显著不同: ayw亚型出现在北非、西非、经地中海到印度次大陆的广阔地区。北欧、西欧、南北美以adw亚型占优势。印度、马来西亚、新几内亚和泰国为adw、adr亚型。亚洲其他地区以adr亚型占优势。我国HBsAg亚型分布,根据全国调查结果表明:西藏、内蒙、新疆为ayw亚型占优势。广西地区为adw亚型占优势。北京、河南、上海等地各省市为adr亚型占优势,ayr亚型在河南某农村两个家庭中曾发现五例。通常用琼脂免疫扩散反应以鉴别亚型,除此以外,其他各种检测HBsAg的灵敏方法均可用于亚型检测。琼脂扩散检测时,相同的亚型与相应的抗-HBs生成相融合的沉淀线;不同的亚型与抗HBs既生成相融合的沉淀线、(因有共同抗原决定簇a),也生成刺突状沉淀线。用不同亚型HBsAg血清,纯化提纯后免疫动物可得到相应的分型诊断血清。用这些血清按照一定的模式作琼脂扩散反应即可对未知的HBsAg进行分型。HBsAg亚型诊断血清在乙肝的流行病学,疫苗的制备和人种学的研究中有重要用途。
(3) HBsAg诊断血球:用绵羊或人的红细胞,经戊二醛、甲醛处理后与纯化的抗HBs反应,使多个抗-HBs分子与红细胞表面连接; 这种带有抗-HBs的红细胞如遇到HBsAg,表面上的抗-HBs即与它们发生免疫反应;由于HBsAg上带有不止一个抗原决定簇,因此能将许多红细胞凝集在一起,称之为反向血球凝集试验(RPHA),简称反向血凝; 这种反应通常在微量血凝板中进行,检测时所需样品量少,敏感度较高,出结果快(约1小时),使用器材简单便予推广,是目前国内检测HBsAg的首选方法,已有冷冻干燥制品。广泛使用于各血库、临床医院、各防疫站、各肝炎研究单位,这种检测方法对减少输血后乙型肝炎、推动肝炎研究工作起了积极作用。
(4) 抗-HBs诊断血球: 用间接血凝(PHA) 方法检测抗-HBs人或绵羊红细胞表面经戊二醛、甲醛固定后与提纯后灭活的HBsAg反应,其原理与HBsAg诊断血清同。本品的敏感度远不如用RPHA方法检测HBsAg,但对于高滴度的抗-HBs反应,如乙肝感染后抗-HBs上升,乙肝疫苗注射后抗-HBs反应应答,乙肝免疫球蛋白的生产鉴定,仍有良好的反应模式,因此,本品适用于中,高滴度抗-HBs筛选择检测。
(5) 酶免疫分析法检测HBsAg及抗-HBs(ELISA):这是近十年来使用的一项免疫学诊断技术,其基本原理是: 抗原抗体蛋白质分子和酶分子以共价键结合方式形成酶联复合物,使其保持原有免疫学和酶学的活性;最常用的酶为碱性磷酸酶和过氧化物酶,由于酶对底物的催化作用,使无色底物发生水解、氧化或还原反应,呈现特定的颜色,表明有酶联复合物存在,而且酶降解底物的多少与颜色深浅成正比,因此可由此而对参加反应的抗原抗体作定性或定量测定。用夹心法测定HBsAg;用中和法测定抗-HBs,前者已有酶标检测药盒生产,检测HBsAg的敏感度较RPHA方法提高50~100倍;所用器皿为聚苯乙烯板或珠子,试验时间5~6小时;本法敏感度高,特异性强,重复性好,不需特殊仪器设备,亦无核素污染的危险,适用于大量筛选,与放射免疫分析法相比,敏感度居第二位,非特异反应偶而可见。计算检测结果公式如下:


如计算值大于或等于2.1时,检测标本为阳性,反之为阴性。
(6) 放射免疫分析法(RIA):用来检测HBsAg及抗-HBs。用核素B13Ⅰ或125Ⅰ标记抗HBs或HBsAg,参于HBsAg与抗HBs的复合物中,然后用γ射线计数器计算其脉冲数(cpm)与正常对照血清作比较,即测得HBsAg、抗-HBs的含量。检测采用夹心法,所用载体为聚苯乙烯珠或板子,国内已有成套的RIA检测HBsAg及抗-HBs试剂盒供应;二个试剂盒中以检测抗-HBs试剂盒的质量较好,估计与HBsAg的纯度有关,1983年全国乙肝诊断用品会议评价,其敏感度已达到国外水平(与Abbott制品相比); 近几年来已广泛用于乙肝疫苗抗HBs反应调查,得到良好的结果; 放射免疫分析法检测HBsAg及抗-HBs是乙肝诊断用品中最敏感的一种。
计算阳性标本的方法如下:


cpm值在2.1以上为阳性,否则为阴性。
乙肝e抗原抗体系统
(1) 琼脂糖免疫扩散法:以琼脂糖为介质,加入由人体采集的抗-HBe及HBeAg血清于扩散孔中,培育2~4天;已知HBeAg、抗-HBe与未知的抗-HBe、HBeAg发生沉淀反应,显示明显的沉淀线,已知HBeAg的成分有e1e2e3,所以可以有三条沉淀线同时见到,或出现二条,或只有一条。该法敏感度很低,但特异性强,仍为各实验室常用方法,试验时必需设置标准对照;标准品可由世界卫生组织提供或由卫生部生物制品检定所颁发。
(2) 酶免疫分析法: 本法较琼脂糖扩散法的敏感度提高50~100倍,检出率可提高3~5倍不等; 具体作法是采集人的抗-HBe,滴度在1:8~1:16以上(琼脂扩散法测定),提取其IgG,以辣根过氧化物酶标记。试验方法同酶免疫分析法检测HBsAg,且检测HBeAg用夹心法,检测抗-HBe用中和法,使用器皿为聚苯乙烯板或珠子,以板子为实用,可节约抗-HBe,人抗-HBe不易获得,而且质量不稳定,如有单克隆抗-HBe抗体生产,则有利于提高制品质量和产量,对进一步研究HBsAg与HBeAg的关系,以及母婴传布中HBeAg、抗-HBe的作用更有重要的流引病学意义。
(3) 放射免疫法:具体原理方法与酶标记方法同,本法敏感度高;但对抗-HBeIgG的质量要求更高,如无高质量的抗-HBeIgG,标记1 25I或131I不能成功, 影响制品质量。
乙肝核心抗原抗体系统
HBcAg;一般可以从HBsAg携带者或乙肝病人尸体肝脏及乙肝病毒感染猩猩肝脏中获得;在无实验猩猩的条件下,以高滴度HBsAg携带者死于其他病者的肝脏为好,具体方法是:将肝脏块除去结缔组织,作成肝匀浆,加入链丝菌酶消化后以差速离心法粗提HBcAg,称之为粗制HBcAg。该抗原可作补体结合试验抗原。本法的敏感度虽不如免疫粘附血球凝集试验及酶免疫分析法和放射免疫分析,但特异性强,试验比较稳定,而且粗制HdAg可用,判读结果时以≥1∶8为阳性。
(2)免疫粘附血球凝集试验(IAHA): 是利用抗原抗体复合物能够结合补体 (C1、C4、C2、C3)的原理,当加入有C2受体的指示细胞后(如灵长类的红细胞),免疫复合物中的C3b部分与指示细胞表面的受体发生粘附而出现凝集现象,只要试验系统中存在极少量的抗原抗体复合物,即可通过与补体系统作用使指示细胞凝集。判定时待检血清凝集滴度≥1∶8时为阳性;试验所用抗原,由粗制HBcAg经密度梯度离心提纯方可应用。
(3)放射免疫分析法: 这是检测抗-HBc最敏感的方法。经抗-HBcIgG包被聚苯乙烯板或珠子,加入适量精制稀释的HBcAg,4℃过液,加入待检血清,然后加入125I标记的抗HBcIgG保温,洗涤后测定其cpm,并计算其抑制率。


(4) 酶免疫分析法: 具体原理及计算方法同放射免疫分析,以酶标记抗-HBcIgG代替125I,本法已有成套抗-HBc试剂盒生产,质量已达到国外中上水平,抗-HBc的检出率与国外Abbott产品相比较,附合率达90%以上;近年来,已试用遗传工程方法生产HBcAg。

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