标记第二抗体 : 第二抗体是一种抗抗体,指用人或动物的抗体Ig作为免疫原,免疫动物产生的抗体Ig,它能与免疫原发生特异性结合。第二抗体可以通过化学方法标记上荧光素、酶或放射性核素,而广泛应用于检验与科学研究,是近代免疫学、血清学上非常重要而锐敏的诊断用品。
20世纪初期已经发现,红细胞或细菌与某种抗体(如在兔Ig中) 之间不出现肉眼可见的结合,加入用兔Ig免疫制成的抗血清后,则出现凝集现象。1945年Coomtbs等用此法检测不完全抗体并获得良好结果,引起广泛重视,称为抗球蛋白试验。随着蛋白化学的发展,开始运用多种标记技术。抗球蛋白试验法又与多种标记技术相结合,在医学生物学等学科中获得广泛应用。这种联合应用,曾被称为自显微镜发明以来生物学和医学科学史上最大的成就之一。所用的诊断用品主要是荧光素标记、酶标记和放射性核素标记的第二抗体,试验方法分别为荧光免疫法、酶免疫法和放射免疫法。其原理见下图:

标记第二抗体示意图

荧光标记第二抗体与荧光免疫法 在一定条件下,某些荧光素能与抗体Ig分子结合而不影响抗体的特异性结合抗原的功能。用这种荧光抗体染标本,能在荧光显微镜下对相应抗原进行鉴定与定位,最常用的荧光素有黄绿色的异硫氰酸荧光素和红色的罗丹明等。先将高效价的第二抗体,即抗Ig诊断血清用硫酸铵盐析法提取球蛋白,在碱性缓冲液和不断的轻微搅拌下加入荧光素使之化学结合,然后用葡聚糖G-25凝胶过滤除去游离的荧光素,加1/10,000硫柳汞等防腐即可供用,F/P比值一般在1～2之间,蛋白含量略高于10mg/ml,工作稀释度在1∶16或更高。冰箱保存效期一年。
荧光抗体染色基本分三类: ①直接法: 本法用的不是标记第二抗体,而是标记抗体直接与检品中的抗原相结合。方法虽较简便,特异性也较好,但敏感性差,其主要缺陷为每检查一种抗原就必需有相应的标记抗体,此种标记抗体一般均无现成的商品。②间接法: 先使未标记的特异性抗体与相应抗原结合,再加与抗体相对应的荧光标记第二抗体。阳性时,出现结合(见图),敏感度较直接法高5～10倍,并且有商品标记第二抗体(抗兔IgG,抗鼠IgG等),以及多种致病微生物的特异性诊断血清,使用非常方便。③补体法: 用标记的抗豚鼠补体C3检查试验前段所形成的抗原-抗体-补体复合物。由于每次需用新鲜补体等缺点,用者不多。荧光免疫法在医学上主要用于快速诊断各种致病微生物和检测组织细胞中的特异性抗原,由于能从细胞水平观察与鉴定,应用相当广泛。
酶标第二抗体与酶免疫法 标记所用的酶有数种,最常用的是辣根过氧化酶和碱性磷酸酶,前者多用联大茴香胺或磷苯二胺等作为底物,后者常用对硝基苯磷酸盐。酶标记第二抗体的方法有戊二醛交联法和过碘酸钠法两类。过碘酸钠法标记率高,产物分子量400,000,是常用的良法,标记为以过碘酸盐氧化与活性无关的酶分子上的糖基成为醛基,使酶易与Ig的氨基结合而成标记抗体。酶标记用的第二抗体需要用纯Ig,生产时多用硫酸铵盐析——DEAE纤维素柱层析法或QAE纤维素柱层析法提取。目前大量供应的酶标第二抗体主要有辣根过氧化酶标记的羊(马、兔)抗人IgG、抗人IgM,羊(马)抗兔IgG,兔(羊)抗鼠IgG等。使用方法中最常用的是酶联免疫吸附试验法(ELISA)及组织化学法。
(1)酶联免疫吸附试验: ELISA的原理是抗原或抗体(蛋白)能被一些固相载体(如塑料管、反应板或是珠子)吸附而包被于其表面,再遇相应抗体或抗原时发生结合,洗去未结合物,再加酶标第二抗体及底物,即出现显色反应。ELISA既特异又高度敏感,用于测定IgE及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)等,敏感度可达0.5ng/ml左右,与号称最锐敏的放射免疫分析法几乎相同。而且酶免疫技术无需放射性核素操作时所必备的防护措施,制剂又非常稳定,效价达一年以上,这是核素标记抗体效期的数十倍。
ELISA方法: ①间接法: 将已知抗原包被于板孔中,加检品血清,有抗体则形成复合物,再加酶标第二抗体及底物即可定量检查检品中的抗体效价。②双抗体夹心法:用已知抗体包被反应板孔,加检品如有相应抗原存在即可结合,再加酶标特异抗体和底物即可测定抗原含量,此法所需标记抗体不是第二抗体,所以随抗原而种类繁多,不胜供应。中国医学科学院基础医学研究所免疫室建立了双抗体夹心改良法、共4层: 已知抗体——待检抗原——已知抗体——酶标第二抗体,从而解决了上述问题,又提高了敏感度。③竞争性抑制法: 先用抗体Ig包被固相吸附后分两份,一份加酶标记抗原和待检抗原,另一份仅加酶标记抗原,孵育后洗涤加底物,待检抗原含量越高,酶标抗原被结合越少,有色产物也就越少,据此可以计算待检抗原的含量。本法主要用于小分子抗原的测定,不使用酶标记第二抗体,而多用酶标记抗原。
(2) 免疫酶组化法: 在组织病理学和病毒学中应用很广。方法多用间接法,即使用组织切片或细胞涂片,检查其中有无某种病毒或抗原时,先用相应的诊断血清处理,洗去游离的抗体后加标记第二抗体,最后加底物,显色,用光学显微镜或电镜观查棕褐色抗原抗体复合物所在的部位,可以做出定位,并可进行形态学研究。
核素标记第二抗体与放射免疫法 由于蛋白质易于结合放射性的卤族原子,本法所用放射性核素主要是131I和1²⁵I,它们的半衰期分别为8天和60天,虽然射线主要都是β粒子,但131I是次高能,125I是低能粒子,射线能量相差很多。标记用的第二抗体需用高纯度的IgG,以DEAE纤维素或QAE纤维素制备,标记工作应在放射性核素工作室进行,遵守放射线使用规定,注意安全,在电磁搅拌下加一定量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Na125I溶液和抗体Ig,然后迅速加入氯胺T促成结合,再加偏重亚硫酸钠中止反应,以葡聚糖G-25柱去除游离的¹²⁵I,此法标记率很高,抗体活性亦好。
放射免疫法包括放射免疫自显影、放射免疫分析和固相放射免疫分析三类:①放射免疫自显影:免疫单扩散板上的抗原抗体复合物结合标记第二抗体后,可用X光底片或银胶乳曝光,然后用显影液及定影液处理观察沉淀圈,其敏感度较扩散试验高出100～1000倍。②放射免疫分析:此法尚有许多具体方法,常用竞争性抑制法,大多不用标记第二抗体,直接用标记抗体进行检测。③固相放射免疫分析:多以特制聚苯乙烯反应板或小管,珠子为固相载体,吸附抗原或抗体蛋白,原理及其步骤大体与ELISA相似。固相放射免疫较不用固相者敏感度高,测蛋白,如(HBsAg)时可达0.3ng/ml,测IgE亦为0.4ng左右,被称为最锐敏的血清学检查法,特异性也好,但放射性核素的工作要求甚高,需有专门的仪器设备与防护,半衰期又很短,有效期常仅为1～2周或近月,难于推广。目前只有大的医疗科研机构使用,不似ELISA在边远地区与基层单位亦可进行。